一文與您分享熒光定量PCR試劑盒的設(shè)計原理
點(diǎn)擊次數(shù)：698 更新時間：2023-05-26
熒光定量PCR(Real-time PCR)技術(shù)是一種能夠?qū)崿F(xiàn)快速、精確、靈敏檢測的分子生物學(xué)方法。其原理是在PCR反應(yīng)過程中同時監(jiān)測靶基因擴(kuò)增產(chǎn)物數(shù)量的動態(tài)變化，從而推算出樣本中對應(yīng)靶基因初始含量的一種手段。
熒光定量PCR試劑盒是熒光定量PCR技術(shù)的重要組成部分，在熒光定量PCR實驗中起著至關(guān)重要的作用。熒光定量PCR試劑盒通常包括模板DNA、引物（Forward和Reverse）以及探針（Probe）、酶（如Taq DNA聚合酶）、熒光染料等多種組分，這些試劑分別發(fā)揮不同作用協(xié)同完成PCR反應(yīng)。
熒光定量PCR試劑盒中的引物和探針的設(shè)計與選擇具有很高的專業(yè)性和針對性，在針對不同的目的和實驗設(shè)計情況下具有各自優(yōu)劣。引物序列需要與所需擴(kuò)增的靶基因區(qū)域匹配，引物都有向前和向后兩個方向，以保證對兩側(cè)位于核苷酸互補(bǔ)鏈上的DNA序列進(jìn)行擴(kuò)增。而探針則要求與引物具有一定的覆蓋長度，其序列應(yīng)優(yōu)化至適合搭配引物并兼顧熒光特性和檢測靈敏度。目前常用的探針是TaqMan探針、MGB探針和MolecularB beacon等。
同時，在PCR反應(yīng)的早期，反應(yīng)產(chǎn)生非特異性PCR產(chǎn)物，這些產(chǎn)品通過DNA雙鏈發(fā)生耦合阻礙擴(kuò)增產(chǎn)物的累積，嚴(yán)重影響了PCR檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。為此，熒光定量PCR試劑盒需要添加Uracil-DNA聚合酶(UDG)和dUTP將殘余外源DNA分解，降低污染以及所得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的假陽性率，提高PCR實驗的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確度。
除此之外，熒光定量PCR試劑盒增加熒光染料和探測器以實現(xiàn)實時監(jiān)控和定量 PCR 反應(yīng)，它能夠不斷進(jìn)行獲取數(shù)據(jù)，在PCR過程中計算核酸擴(kuò)增本原數(shù)量，并在實時顯示屏幕上展示出制品的表達(dá)大小。因此，熒光定量PCR技術(shù)廣泛應(yīng)用于基因分型和基因定量以及細(xì)胞凋亡等相關(guān)研究。
